شناسایی لکه های مشکوک به ترشحات جنسی در علوم جنایی

تولید می­کنند. در اثر تابش این امواج به لکه­های که حاوی مایع سمن هستند، باز تابش نوری، با طول موج­های بلندتر از نور تابیده شده دراین مایع ایجاد می­شود که سبب درخشش این لکه­ها در اثر تابش نور ماوراء بنفش می­گردد. این امواج باز تابشی در حدود 300 تا 700 نانومتر می­باشند و دارای دو پیک مشخص در حدود 460 تا 520 نانومتر و دیگری در محدوده 600 تا 700 نانومتر است.

در این خصوص می­توان به مطالعه­ی که زندیه و همکارانش با استفاده از پردازشگر نوری  PL500 انجام داده­اند اشاره داشت. هدف این مطالعه جداسازی مایع منی انسانی و حیوانی در شرایط مختلف و انواع رنگ­های پس زمینه­ای الیاف مختلف انجام شد. در این مطالعه لباس­های آغشته به نمونه­های مایع منی و بزاق برای 5-3 هفته نگهداری شدند و برخی از آنها توسط دترجنت­های خانگی و آب با دمای 30 درجه سانتیگراد شستشو شدند، سپس با استفاده از پردازشگر نوری قابل حمل   PL500 و با طول موج­های 320 نانومتر ماورای بنفش تا 700 نانومتر نور مرئی و مادون قرمز و عینک­های رنگی و فیلترهای مختلف لکه­های منی و بزاق مورد شناسایی قرار گرفتند (زندیه و سعادتی، 1388: 1).

در مطالعه ای که در سال 2015 توسط هارل^[4] و همکارانش صورت گرفته بود توانستند از طریق شناسایی لکه­های برجای مانده سمن که بر روی لباس قربانی باقی مانده بود گروه خونی فرد متهم را تعیین کنند. این گروه از طریق بکارگیری منبعی با شدت نوری بالا توانستند که لکه­های مشکوک به مایع منی را هم در تاریکی شب و هم در نور روز با طول موج بین 415 تا 490 نانومتر شناسایی کنند. بعد از شناسایی لکه­های منی با این روش آنها توانستند با استفاده از روش جذب – شستشو^[5] گروه خونی فرد صاحب لکه­های مایع منی را شناسایی کنند و از این طریق توانستند پرونده قتل دختر پنج سالی که بر اثر تجاوز به قتل رسیده بود را شناسایی کنند (هارل و همکاران، 2015: 2و3)

البته باید این نکته را در نظر گرفت که بعضی از مایعات بیولوژیکی از جمله بزاق نیز در اثر تابش اشعه ماوراء بنفش از خود نور فلورسانس ساطع می­کند. ممکن است این روش برای شناسایی لکه­های که حاوی مایع منی قدیمی باشند، موثر نباشد. به­همین دلیل برای اجتناب از نتایج مثبت کاذبی که در خصوص سایر ترکیبات ایجاد می­گردد، به­کارگیری تست­های دیگری در کنار اشعه ماوراء بنفش، الزامی می­باشد ( جاکسون و هادی[6] 2007: 365). 

1-2-3- شناسایی لکه­های مشکوک به وجود اسپرم با آزمون کریستال

از تست­های مقدماتی دیگری که برای شناسایی مایع سمن بکار می­رود، آزمون کریستال است. این روش شناسایی یکی از قدیمی­ترین روش­های مورد استفاده برای تشخیص این مایع می­باشد که تا حدودی شبیه به آزمون کریستال برای خون است. در آزمون فلورانس^[7] که جزء تست­های کریستال می­باشد، از محلول ید-یدید برای کریستال کردن کولین موجود در منی به­صورت یدید کلولین استفاده می­شود. در حالی که در تست باربریوس^[8] پیکریک اسید باعث کریستال شدن اسپرمین موجود در مایع سمن به اسپرمین پیکرات است. به­غیر از تست­های ذکر شده، چندین روش آنزیمی و کروماتوگرافی نیز برای تشخیص و شناسایی اسپرمین و کولین موجود در لکه­های منی موجود در صحنه جرم وجود دارد که به اقتضاء امکانات آزمایشگاه­های ذیربط، از این تست­ها در شناسایی لکه­های مایع منی استفاده می­شود.

1-2-4- شناسایی لکه­های مشکوک باآزمون اسیدفسفاتاز

بیشترین تست مقدماتی که در شناسایی و گاهی اوقات سنجش کمی لکه­های مشکوک به منی به­کار گرفته می­شود، تست اسید فسفاتاز است که از آنزیم اسید فسفاتاز موجود در مایع منی که به SAP ^[9]معروف است، استفاده می­شود. اسید فسفاتاز آنزیمی، پروتئینی است که از چندین زنجیره پلی­پپتیدی تشکیل شده است. ساختار فضایی آن به گونه­ای است که پس از قرارگیری سوبسترایش در جایگاه فعال آن باعث کاتالیز واکنش آنزیمی مربوطه می­شود. این آنزیم متعلق به گروه آنزیم­های هیدرولاز می­باشد و به­صورت چندین فرم ایزوآنزیم با عملکرد آنزیمی رایج که شکست هیدرولیتیکی استرهای منو فسسفات است، وجود دارد.

به­طور معمول مایع منی انسان شامل مقادیر زیادی از آنزیم اسید فسفاتاز است، که با غلظتی در حدود 1/0 تا 3/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر توسط غده پروستات تولید می­شود. فعالیت آنزیم اسید فسفاتاز در سایر مایعات فیزیولوژیکی موجود در بدن از جمله سرم بسیار کم و یا بطور کل فاقد فعالیت است. مقدار اسید فسفاتاز موجود در مایع واژینال بسیار کمتر از مایع منی است، بنابراین می‌تواند یک آزمایش تشخیصی برای نمونه‌هایی باشد که احتمال آغشتگی مایع منی با مایع واژن در آنها وجود دارد.

اولین بار در سال 1940 از آنزیم اسید فسفاتاز به­عنوان یک شناساگر برای شناسای لکه­های مشکوک به مایع منی استفاده شده است. این روش آزمایشگاهی از آن به بعد در اکثر آزمایشگاه­های جنایی و پزشکی قانونی برای شناسایی و غربالگری لکه­های مشکوک به مایع منی استفاده می­گردد. برای سنجش آنزیم اسید فسفاتاز روش­های متعددی همچون الکتروفورز، الایزا و رادیو ایمنواسی وجود دارد. روش متداول اندازه­گیری این آنزیم کالریمتری یا همان رنگ سنجی می­باشد.

اسید فسفاتاز باعث هیدرولیز فسفات آلی به محصولی می­شود که قادر است با نمک کروموژن^[10] دیازونیوم ^[11]یک ترکیب رنگی تولید کند. این آنزیم در حضور فسفریک اسید با pH حدود 5 تا 6، مناسب­ترین فعالیت را دارد. این آنزیم، در اثر واکنش هیدرولیزی که کاتالیز می­کند باعث تبدیل سوبسترای خود، به فنل و یون فسفات می­شود. فنل تولید شده با نمک دیازونیوم که یک کروموژن است یک کمپلکس رنگی بنفش ایجاد می­کند، که نشان دهنده مثبت بودن آزمایش و وجود منی در نمونه مورد آزمایش است. این واکنش، پایه تمام تست­های است که بر اساس اسید فسفاتاز برای شناسایی مایع منی بکار گرفته می­شوند. با توجه به این­که این آنزیم به طور عمده با غلظت بالای در پروستات و حدود هزار برابر بیشتر درمایع منی نسبت به سایر مایعات بدن وجود دارد، اساس استفاده در آزمایشات جنایی و پزشکی قانونی شده است. این واقعیت در علوم قضایی و جنایی کاربرد زیادی پیدا کرده است، زیرا تشخیص وجود اسید فسفاتاز پروستات در مقادیر بیشتر از سه برابر معمول در بافت واژینال به عنوان شاهدی مبنی بر وقوع یک تجاوز جنسی قلمداد می­شود. آزمایش دیگری که تایید می­کند این آنزیم منشاء منی دارد تا مایع واژینال از طریق بررسی و میزان سنجی مقادیر ایزوآنزیم­های گوناگون اسید فسفاتاز است که در پروستات یافت می­شود. در صورتی که این ایزوآنزیم­ها در ترشحات واژینالی دیده نمی­شوند. علاوه بر این همزمان با این تست عموما یک تست آنتی­ژن ویژه پروستات (PSA) نیز انجام می­شود که وجود اسپرم را تصدیق می­کند ( پی. هوف و وان دی وورد[12]،46:1992).

یکی از بهترین سوبستراهای که برای این واکنش به منظور شناسایی مایع منی بکار می­رود، آلفا نفتیل فسفات به همراه برنتامین فست بلو می­باشد. ترکیب دیگری که می­تواند یک سوبسترای مناسب برای این واکنش باشد بتا نفتول به همراه فست گرنت بی و آلفا نفتول به­همراه فست رد می­باشد. علاوه بر ترکیبات ذکر شده تیمول فتالئین سدیم منوفسفات برای این آنزیم بسیار انتخاب­پذیر و پایدار است و نسبت به ترکیبات ذکر شده، خطر کمتری برای پرسنل استفاده کننده دارد  ( سیدن و دونکن[13]،1983: 207).

برای انجام آزمایش لکه مشکوک به منی، با رعایت نکات اصولی بعد از جمع­آوری از صحنه جرم با یک برگ کاغذ واتمن مرطوب شده و سپس معرف ‌اسید فسفاتاز که معمولا ترکیبی از آلفانفتول و کلرور روی است، روی آن اضافه می‌شود. تشکیل کمپلکس بنفش رنگ، در فاصله زمانی30 ثانیه دلیل وجود مایع منی و مثبت‌ بودن آزمایش است.

البته در این آزمون احتمال بروز نتایج مثبت کاذبی نیز وجود دارد. به­عنوان مثال برخی از ترکیبات گیاهی و حتی اسید فسفاتاز واژن (VAP)، می­توانند باعث بروز نتایج مثبت کاذب شوند. بنابراین این روش نمی­تواند به­عنوان یک تست تاییدی در نظر گرفته شود. یک راه برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب بالقوه­ای که برای VAP بوجود می­آید، تغییر رنگی است که در عرض 5 تا 30 ثانیه برای اسید فسفاتاز موجود در مایع منی رخ می­دهد. زیرا در ترشحات واژینال غلظت خیلی کمتری از اسید فسفاتاز دارد، و هرگز نمی­تواند در این فاصله زمانی باعث تغییر رنگ مورد نظر شود. آزمایش دیگری که می­توان بر اساس آن اسید فسفاتاز منی و واژینال را از هم متمایز کرد روش ایزو الکتریک فوکوزینک و الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید می­باشد. در آزمون­های مربوط به شناسایی SAP معایبی وجود دارد، از جمله این­که آنزیم در اثر قرار گیری در معرض گرما و مواد شیمیایی تخریب می­گردد که خود باعث بروز خطا در نتایج آزمایش می­شود.

در سال 2017 کیتی تحت عنوان اسپرم ترکر[14] توسط بروگز^[15] و همکارانش، به عنوان یک محصول تجاری ویژه برای تشخیص و ردیابی مایع منی طراحی شد. این محصول جدید امکان استفاده از خاصیت اسید فسفاتاز را به عنوان یک کیت غیر سمی بهبود بخشید. یکی از مهمترین مزایای این کیت نسبت به روش­های مرسوم اسیدفسفاتاز این است که بعد از شناسایی نمونه توسط این کیت مجددا می­توان از نمونه شناسایی شده برای آزمایشات بعدی استفادکرد و تخریب نمی­شود، در صورتیکه در سایر روش­های شناسایی اسیدفسفاتاز نمونه شناسایی شده قابل بازگشت نیست  ( بروگز و همکاران، 2017: 4-2).

1-2-5- شناسایی لکه­های مشکوک به مایع سمن بر اساس تست­های مقدماتی بر اساس حضور آنزیم­های ویژه

علاوه بر تست اسید فسفاتاز تست­های مقدماتی مشابه­ای بر اساس حضور آنزیم­های دیگر برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی موجود در صحنه جرم وجود دارد، اما نسبت به تست SAP عمومیت کمتری دارند. یکی از این آنزیم­ها آمینوپپتیداز لوسین^[16]  (LAP)است. در یک مطالعه مقایسه­ای که توسط گروهی از محققین علوم جنایی انجام شده است، مشخص گردید که نتایج حاصل از آزمون­های SAP و LAP نتایج مثبت کاذب کمتری با سایر مایعات بدن انسان، میوه­ها، و سبزیجات را ایجاد می­کند. اما این آنزیم قادر به تشخیص مایع سمن سایر گونه­ها نیست و نتایج منفی را در این خصوص نشان می­دهد ( کیدو[17] و همکاران، 1999: 128) .

آنزیم دیگری که می­تواند در شناسایی این مایع بکار رود، آنزیم گلایسیل پرولین دی پپتیدیل آمینو پپتیداز^[18] یا  GDA است. نتایج حاصل از این آزمایشات نشان می­دهد که نمونه­هایی از لکه­های سمن که مربوط به 24 سال پیش می­باشد توسط این روش قابل شناسایی هستند. اما این آنزیم نتایج مثبت کاذبی را با مایع واژن، مدفوع، توت فرنگی، لوبیا و پیاز ایجاد می­کند ( کاتسومتا، ایا و میزوتانی[19]، 1991: 357).

یکی دیگر از آزمایشات تشخیصی مایع سمن مبتنی بر آنزیم سیستئین آمینوپپتیداز ^[20] (CAP) است. مقدار این آنزیم دراین مایع نسبت به سایر مایعات بیولوژیکی بدن شایع­تر است و حدود صد برابر بیشتر است. زمانی که این آزمایش بر روی سایر مایعات بدن از جمله مایع واژن و مدفوع انجام می­شود، امکان بروز نتایج مثبت کاذبی که با برخی از آزمون­های آنزیمی که قبلا ذکر شده است، وجود ندارد. تنها نتایج مثبت کاذب برای چند میوه و سبزیجات، از جمله توت فرنگی مشاهده شده است.

آزمایشی که بر پایه آنزیم جی گلوتامیل ترانسفراز (G-GTP) با کمک نمک فست گارنت GBC و نفتیل آمین به­عنوان شناساگر برای شناسایی لکه­های مشکوک به منی طراحی شده است زمانی که بر روی لکه­های منی قدیمی با قدمت 23 سال انجام شد نتایج مثبتی را در خصوص شناسایی این لکه­های قدیمی داشت. اما در خصوص مایعاتی از جمله شیر مادر، مایع واژن، نخود سبز، لوبیا، پیاز، توت فرنگی، سیب و آلو نتایج مثبت کاذبی را نشان ­می­دهد.

آزمون دیگری که برای شناسایی لکه­های مایع سمن به­کار برده می­شود بر اساس واکنشی است که با عنصر روی (زینک) موجود دراین مایع انجام می­شود، طراحی شده است. نتایج نشان می­دهد این روش از نظر مقاومت و تخریب نسبت به روش SAP روشی مناسب­تر، برای شناسایی و بررسی مایع سمن است. همچنین نتایج مثبت کاذبی که در خصوص شناسایی لکه­های مشکوک به این مایع با سایر واکنش­های آنزیمی برای مایعات دیگر بدن، میوه­ها و سبزیجات ایجاد می­شده است، در این روش دیده نمی­شوند. از سوی دیگر این روش می­تواند لکه­های آغشته به مایع منی با قدمت 25 سال را به خوبی شناسایی کند( سوزوکی ، کیدو و اویا[21] 1983: 233). علاوه بر این، نتایج حاصل از آزمایش­های مربوط به تست­های نواری روی در مقایسه با تست­های نواری SAP نشان می­دهد که تست­های نواری روی از نظر حساسیت و ویژگی مشابه با تست­های نواری SAP می­باشند ) پی.جی. هوفت و وان دی وورد[22] 1997: 46).

1-2-6- شناسایی لکه­های مشکوک به مایع سمن بر اساس کولین و اسپرمین

یکی دیگر از آزمایشات مقدماتی که مدت زیادی است به­عنوان یک تست شناسایی برای تشخیص این مایع از آن استفاده می­شود، آزمایشاتی است که از طریق آنها، حضور کولین در لکه مشکوک بررسی می­شود. یکی از این آزمایشات، تست فلورانس می­باشد. همان­طور که در قسمت­های پیشین توضیح داده شده است، این تست جزء آزمون­های کریستال برای شناسایی می­باشد. در این روش مقداری از نمونه مشکوک به سمن را روی اسلاید میکروسکوپ قرار داده سپس مقداری از محلول ید و یدید پتاسیم به آن اضافه کرده، در صورت تشکیل کریستال­های سوزنی مانند قهوه­ای رنگ در نمونه مورد آزمایش، دلیلی بر وجود حضور منی در لکه­های مورد بررسی می­باشد. در این روش امکان بروز نتایج منفی کاذب به علت حساسیت کم آزمایش وجود دارد. این آزمون برای مایعات دیگر بدن از جمله مایع واژن و همچنین مایع منی گونه­های حیوانی دیگر منفی است ( هوپکینس[23] و همکاران 1987: 1070). روش­های دیگری برای تشخیص و شناسایی کولین موجود در مایع وجود دارد که بر اساس واکنشی که با اکسیداز کولین رخ می­دهد، طراحی شده است، و جزء تست­های کمی­لومینسانس محسوب می­شود. این آزمایش حاوی محلول کولین اکسیداز و لومینول می­باشد ( مانابی[24] و همکاران 1991: 209). روش­های پیچیده­ای دیگری نیز برای شناسایی مایع منی وجود دارد که برا اساس ایزوتاکوفروز ^[25]است که هیچ­گونه جواب مثبت کاذبی با سایر مایعات بدن، میوه­ها و سبزیجات ایجاد نمی­کند. این آزمون برای لکه­های مایع منی با قدمت ده سال دارای نتایج قابل قبول و مثبتی می­باشد. همچنین در شناسایی و تشخیص مایع سمن که با سواب از واژن زن متوفی نمونه برداری شده است نیز موفق بوده است( اوکی، تسوتسومی و ایشیزو[26]، 1988: 2). 

یکی دیگر از تست­های مقدماتی که در گذشته برای شناسایی مایع منی رایج بوده، اما در حال حاضر از آن استفاده کمتری می­شود، شناسایی پلی آمین­های همچون اسپرمین(SPM) ^[27] موجود در مایع منی است. اسپرمین بیشترین غلظت را در میان پلی آمین­های موجود در مایع منی را دارد. با کمک کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا^[28] (HPLC) به همراه یک استخراج ساده با این روش می­توان مایع منی را شناسایی کرد. HPLC یک روش حساس برای تشخیصSPM  در مقایسه با روش­های چون کروماتوگرافی کاغذی یا همانTLC  ، ایزو تاکوفورز لوله مویین و روش آنزیمی است. شایع­ترین نتایج مثبت کاذبی که با این روش حاصل می­شود درخصوص ترکیباتی چون سس سویا است. اما با سایر ترکیبات همانند آب میوه و سبزیجات نتایج مثبت کاذبی ایجاد نمی­شود ( ساتو و همکاران، 42:1996). تست دیگری که در گذشته برای شناسایی اسپرمین از آن استفاده می­شد، تست باربریو^[29] است،که شامل تایید میکروسکوپی کریستال­های زرد رنگ اسپرمین است. در این آزمایش وقتی لکه مشکوک به مایع منی در معرض محلول آبی اسید پیکریک قرار می­گیرد کریستال­های زرد رنگ اسپرمین ظاهر می­شوند. این تست نسبت به روش فلورانس نتایج قابل قبول­تری برای شناسایی و تشخیص مایع منی از خود نشان می­دهد.

همچنین این تست در شناسایی لکه­های سمن با قدمت سه سال که دمای 150 درجه سانتی­گراد بوده اند، نیز موفق بوده است. آزمایش دیگری نیز مشابه این تست بنام پانن^[30] وجود دارد که جزء تست­های کریستال می­باشد. در این روش از نفتول زرد به­عنوان واکنش­گر استفاده می­شود و وجود کریستال­های نارنجی در نمونه مورد آزمایش گواه بر مثبت بودن حضور اسپرمین در لکه مورد نظر است.

یکی دیگر از تست­های که به تازگی در شناسایی لکه­های مشکوک به سمن بکارگرفته شده است تست RSID^TMمی­باشد. این تست در سال 2019 توسط رودریگز^[31] و همکارانش برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع سمن و نهایتا تعیین پروفایل ژنتیکی نمونه­های مورد نظر در آزمایشگاه جنایی بر روی نمونه­های فیلیپینی بکار گرفته شده است. این تست بر اساس شناسایی سمینوگلین^[32] انسانی (Sg) از طریق ایمنوکروموتوگرافی طراحی شده است، سمینوگلین پروتئینی که به وفور در مایع منی وجود دارد. این استریپ طوری طراحی شده است که نتیجه آن با ظهور خطوط رنگی بر روی نوار قابل خوانش است. در این روش نمونه­ی را که حدس می­زنند مشکوک به مایع منی باشد را روی این استریپ انکوبه می­کنند، ظهور دو خط قرمز روی نوار نتیجه مثبت را نشان می­دهد در حالی که یک خط واحد به معنی منفی بودن نتیجه تست است. حساسیت این روش به قدری است که نمونه­های مایع منی که با سایر نمونه­ها از جمله ترشحات واژینالی مخلوط شده است را به خوبی شناسایی می­کند (رودریگز و همکاران، 2019: 4و7).

روش دیگری نیز برای شناسایی لکه­های مشکوک وجود دارد که با روش­های ذکر شده قبلی کاملا متفاوت است، و در حال حاضر نیز استفاده می­شود ولی عمومیت چندانی در مقایسه با تست SAP ندارد. اساس این روش استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی^[33] (SEM) و اشعه X برای تشخیص سدیم، فسفر، گوگرد، کلر، پتاسیم،کلسیم، و دیگر عناصر فلزی موجود در مایع منی است. این عناصر در مایعات مختلف بدن، با نسبت­های متفاوتی وجود دارند. بررسی این نسبت­ها منجر به شناسایی لکه­های مختلف مایعات بدن می­شود. نمودار حاصل از عناصر موجود در مایع سمن نشان می­دهد که در میان عناصر ذکر شده، بلندترین پیک مربوط به کلر است که از طریق این پیک می­توان مایع منی را شناسایی کرد. همچنین پیک مربوط به عنصر کلسیم را نیز می­توان به­عنوان یک نشانگر برای شناسایی مایع منی بکار برد ( ساتو و همکاران, 1996: 41-43) .

1-3- تست­های تاییدی برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی موجود در صحنه جرم

1-3-1- شناسایی لکه­های مشکوک به سمن بر اساس وجود اسپرم

یکی از قابل اطمینان­ترین روش­های تأییدی که برای تشخیص و شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی مورد قبول محققین علوم جنایی می­باشد، بررسی میکروسکوپی سلول­های اسپرم موجود در مایع است. این مایع، تنها مایعی از بدن می­باشد که دارای سلول­های اسپرم است. مقدار زیادی از DNA را می­توان در سلول اسپرم با روش­های مناسب رنگ آمیزی DNA مشاهده کرد. مرسوم­ترین روش در این خصوص بررسی حالت درخت کریسمس برای اسپرم است که بر اساس شناسایی رنگ اسپرم است، که در این حالت سر اسپرم به رنگ قرمز و تاژک آن به رنگ سبز قابل تمایز است. برای مشاهده بهتر سلول­های اسپرم می­توان از محلول پروتئیناز K استفاده کرد. این آنزیم باعث از بین بردن پوشش اسپرم از طریق دناتوره کردن دیواره آن شده و موجب رویت بهتر اسپرم می­گردد. روش­های رنگ آمیزی دیگری برای شناسایی سلول­های اسپرم موجود در مایع منی وجود دارد همانند هماتوکسیلین و ائوزین که نسبت به روش رنگ آمیزی کریسمس کاربرد کمتری در شناسایی اسپرم دارد ( جونز[34]، 2005: 350-357).

روش هیبرید سازی فلوئورسانت درجا (FISH)^[35] یکی دیگر از روش­های می­باشد که می­تواند در شناسایی سلول­های اسپرم و نهایتا ترشحات مشکوک به مایع سمن مفید باشد. فیش، نام روشی است که طی آن نمونه  بصـورت همراه یا جدای از پروب­هـای DNA کنترل بـا کروموزوم­های متافازی هیبرید شده تـا نمونه هدف شناسـایی شـود. واژه فلوئورسـانت به معنای ساطع شدن نور از یک ملکول فلوئرفر پـس ازتحریـک آن می­باشد، و In Situ ااشاره به این حقیقت دارد که این روش با کروموزوم، سلول یا بافتی انجام می­شود که روی یک اسلاید میکروسکوپی تثبیت شده است. بر همین اساس در سال 2011 میلر^[36] و همکارانش موفق به ساخت کیتی تحت عنوان SPERM HY-LITER™ شدند که می­توان گفت اولین کیت تجاری ایمونوفلورسانس جهت شناسایی و غربالگری سلول­های اسپرم موجود در نمونه­های مربوط به تجاوزات جنسی می­باشد ( میلر و همکاران، 2011: 857-860).

البته روش­های میکروسکوپی دارای معایبی هستند که بزرگترین ضعف این روش­ها مربوط به افرادی است که مایع سمن آنها به علل طبیعی و یا وازکتومی فاقد اسپرم است که به این افراد اصطلاحا آزواسپرم گفته می­شود. برای رفع این مشکل، آزمایشات دیگری مبتنی بر مواد شیمیایی برای شناسایی مایع منی توسعه یافته است.

1-3-2- شناسایی لکه­های مشکوک بر اساس آنتی­ژن اختصاصی پروستات^[37](PSA)

یکی از این تست­های تاییدی که مورد قبول تمامی کارشناسان علوم جنایی می­باشد و با اهمیت­تر از جستجوی سلول­های اسپرم در مایع منی است، آزمایشی است که بر اساس آنتی­ژن اختصاصی پروستات (PSA) طراحی شده است. آنتی­ژن اختصاصی پروستات برای اولین ‌بار توسط هارا^[38] و همکارانش درسال 1971 به‌عنوان یکی از ترکیبات اصلی در مایع منی با غلظت بالای 10⁶میکروگرم در لیتر کشف گردید. PSA  در سال 1979 از بافت پروستات جدا شد و جزء آنزیم­های پروتئازی طبقه بندی می­شود و درخانواده سرین پروتئازها قرار می‌گیرد. این آنزیم فعالیتی مشابه با کیموتریپسین دارد و براساس عملکرد، ساختمان و جایگاه ژنی عضو خانواده کالیکرئین‌ها^[39] محسوب می‌شود ( یوسف[40] و همکاران،1999: 4254).

PSA به اشکال مختلف درپلاسما وجود دارد، از سلول­های اپیتلیال غده پروستات ترشح می­شود. نقش فیزیولوژیکی مهم آن ذوب منی منعقده شده بعد از انزال می‌باشد و سبب روان شدن منی شده و موجب حرکت آزاد اسپرم می­گردد. در پروستات آنزیم PSA به شکل یک پیش مولکول غیرفعال است که توسط کالیکرئین 2KLK2  فعال می­گردد. در پروستات، غلظت یون روی ده برابر بیشتر از سایر مایعات بیولوژیک است که از فعال شدن این آنزیم درpH  قلیایی، جلوگیری می­کند. آنزیم PSA به علت وجود اسید لاکتیک و pH اسیدی که در محیط واژینال وجود دارد خاصیت بازدارندگی خود را از دست داده و به فرم فعال خود، تبدیل می­شود. گرچه نقش PSA دربافت‌های دیگر به‌ خوبی شناخته ‌نشده است، ولی بعضی از پژوهش­گران معتقد هستند که این پروتئین می‌تواند به­عنوان یک فاکتور رشد سلولی عمل نماید. PSA همچنین موجب تجزیه و انحلال کوآگلوم یا همان موکوس گردن رحم شده و ورود اسپرم به رحم را تسهیل می­کند. این آنزیم حتی در مردان آزواسپرم که فاقد اسپرم هستند نیز، وجود دارد. به همین دلیل PSA به­عنوان یک نشانگر زیستی مناسب برای تشخیص مایع منی محسوب می­شود، که حتی در مردان فاقد اسپرم یا وازکتومی شده که مجاری اسپرم ساز آنها بسته می­باشد نیز وجود دارد و یک راه مطمئن در شناسایی مایع منی در این افراد است. این آنزیم به مقدار بسیار جزیی در بعضی از مایعات بیولوژیکی بدن مثل شیر و ادرار جنس مونث و در سرم مردان در صورت ابتلا به سرطان پروستات نیز دیده می­شود. لیکن با تعیین آستانه کمی برای مایعات بیولوژیک غیر از مایع منی، نتایج مثبت کاذب قابل تفسیر خواهند بود. یک جنبه مهم این آزمایش در تشخیص PSA شامل توانایی این تست برای تشخیص نمونه­های آلوده و یا کمیاب از جمله پارچه­های آلوده و اجساد تجزیه شده می­باشد.

روش­های اصلی همانند ایمونوالکتروفورز یا الایزا، و برخی از روش­های خاص شامل روش ایمونواسی دات بلات با پروتئین نشاندار A و همچنین روش دات ایمونوبلاتینگ، از جمله روش­های می­باشند که در شناسایی PSA در آزمایشگاه­های علوم جنایی و پزشکی قانونی بکار برده می­شوند.

1-3-2-1- کیت­های طراحی شده بر اساس PSA برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی

در حال حاضر چندین کیت بر اساس واکنش آنتی­بادی- آنتی­ژن بر پایه شناسایی آنتی­ژن PSA موجود در مایع سمن طراحی شده است، که استفاده از آن­ها برای کارشناسانی که در صحنه جرم هستند بسیار سریع و آسان است. یکی از این کیت­ها Biosign1 PSA است، که استفاده از این کیت نسبت به روش سنتی الایزا ساده­تر و ارزان­تر می­باشد (ماهر[41] 2002: 47). این آنزیم همچنین با استفاده از روش ایمنوکروماتوگرافی و کیتABAcard  قابل شناسایی است. در این روش در صورت مثبت بودن آزمایش یعنی وجود منی در لکه مشکوک مورد آزمایش، آنتی­بادی منوکلونال موجود در کیت با اتصال بهPSA  انسانی و حرکت در طول نوار، یک خط رنگی قابل مشاهده تشکیل می­دهد. این آزمایش به روش زیر برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی که از صحنه جرم جمع­آوری شده است انجام می­شود. کیت مورد نظر حاوی یک لایه غشاء مانند است که روی این غشاء دو آنتی­بادی منوکلونال فعال تثبیت شده است. یکی از این آنتی­بادی­ها مربوط به شناسایی لکه مورد آزمایش است. علاوه بر این، آنتی­بادی منوکلونال دیگری به­عنوان شاهد، در ناحیه کنترل بر روی غشاء تثبیت شده است. آنتی­بادی که به­عنوان استاندارد در این کیت استفاده می­شود با غلظت مشخصی که تقریبا حدود چهار نانوگرم در میلی­لیتر است برای ایجاد خطی با رنگ مشخص در ناحیه کنترل تثبیت شده است که تقریبا برابر با میزان پاسخ دهی ناحیه آزمایش است. در بین ناحیه آزمایش و ناحیه کنترل، آنتی بادی­های پلی­کلونال تثبیت شده است. نمونه را به لایه دوم که دارای دومین آنتی­بادی منوکلونال نشاندار شده با طلا است، به غشاء منتقل می­کنند. در صورت وجود مایع منی در لکه­های جمع­آوری شده از صحنه جرم،  PSAموجود در نمونه، به آنتی­بادی منوکلونال نشان­دار شده با طلا، متصل شده و کمپلکس آنتی­ژن PSA و آنتی PSA نشان­دار شده با طلا، تشکیل خواهد شد. در اثر خاصیت موئینگی غشاء و حرکت کمپلکس و ترکیب آن با آنتی­بادی ناحیه کنترل و ناحیه استاندارد، دو خط قرمز یکی برای کنترل و دیگری برای استاندارد داخلی تشکیل می­شود. تشکیل این خطوط مستقل از وجود PSA موجود در نمونه مورد آزمایش است و صحت انجام آزمایش و سالم بودن اجزاء کیت را تایید می­کند. اگر نمونه مشکوک حاوی PSA باشد، کمپلکس PSA و آنتی PSA نشان دار شده با طلا به آنتی­بادی منوکلونال تثبیت شده در ناحیه آزمایش متصل شده و یکی دیگر از اپی­توپ­های مولکول PSA. را، شناسایی می­کند. این اتصال، باعث ایجاد یک خط اضافی می­شود. بنابراین در پایان آزمایش در صورت مثبت بودن وجود PSA سه خط رنگی بر روی غشاء ظاهر می­گردد. خط وسط برای استاندارد داخلی و برای غلظت چهار نانوگرم در میلی لیتر PSA تنظیم شده است. که می­توان با مقایسه خط حاصل از نمونه مشکوک به مایع منی، علاوه بر شناسایی لکه مورد نظر غلظت تقریبی PSA موجود در نمونه را نیز تخمین زد ( هیالی[42] و همکاران، 2007: 126- 129).

حساسیت این کیت به اندازه­ای است که می­توان PSA­ای مایع منی که 10⁶بار رقیق شده است را تشخیص داد و تنها نتیجه مثبت کاذب دیده شده با این کیت مربوط به نمونه ادرار جنس مذکر است ( کیارسی، لوین و پون 2001: 65). علاوه بر این کیت، کیت­های تجاری دیگری برای شناسایی مایع منی وجود دارد که عبارتند از: Chembio Medpro و   Onco-screen ( هیالی و همکاران 2007: 128). این کیت­ها که اصولا بر پایه واکنش آنتی­بادی- آنتی­ژن طراحی شده­اند بسیار دقیق هستند و استفاده از آن­ها برای کارشناسان مربوطه نیز بسیار راحت است.

یکی دیگر از کیت­های شناسایی منی، کیت Sema1 است که یک نوع کیت الایزا است که بر اساس واکنش بین آنتی­بادی ضد MHS-5 و SVSA طراحی شده است. MHS-5، به­عنوان یک ایمونوگلوبولین G1 و آنتی­ژن اختصاصی مایع منی (SVSA)^[43] شناخته شده است. این آنتی­ژن تنها در سلول­های اپیتلیوم کیسه­های منی انسان وجود دارد. پروتئین­های عمده­ی تشکیل دهنده مایع منی انسان، سمینوگلین یک و دو، هر دو حاوی SVSA هستند که می­توان آنها را توسط آنتی­بادی منوکلونال ضد MHS-5 شناسایی کرد. این کیت قادر است نمونه­های حاوی مایع منی که به اندازه­ی 10⁶ بار رقیق شده است را شناسایی کند اما اختصاصی بودن آن به اندازه کیت­های PSA نیست.

1-3-3- شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی بر اساس ایزوآنزیم­های لاکتات دهیدروژناز و گلوتامیل ترانس پپتیداز - جی

از طریق بررسی ایزوآنزیم­های لاکتات دهیدروژناز (LDH) نیز می­توان حضور مایع منی یا خون را در لکه­های مشکوک جمع­آوری شده از صحنه جرم را بررسی کرد. اساس این شناسایی به حضورLDH-3  وLDH-4  بر می­گردد. ردیابی این دو ایزوآنزیم توسط الکتروفورز امکان­پذیر می­باشد و نتایج مثبت قابل قبولی در خصوص شناسایی لکه­های مایع منی با قدمت حداقل 30 هفته و نمونه­های سوابی که پس از مقاربت از واژینال جمع­آوری شده، را نشان می­دهد (گاببی[44] و همکاران 1992: 702). با این روش حتی می­توان اسپرم­های که در مخلوطی از خون و مایع واژن قرار دارند را تشخیص داد، البته این روش در آزمایشگاه­های جنایی و پزشکی قانونی مدرن معمولا استفاده نمی­شود.

ایزوآنزیم دیگری که می­توان از آن برای شناسایی مایع منی استفاده کرد، گلوتامیل ترانس پپتیداز - جی^[45] (GGT)  است. این ایزوآنزیم در پلاسمای مایع منی نسبت به دیگر مایعات بدن بسیار فعال­تر است. ایزوآنزیم­های دیگری نیز وجود دارد که از آن­ها می­توان برای شناسایی مایع منی بهره برد. از جمله می­توان به کراتین فسفوکیناز(CPK)  و انواع مختلف استرازها اشاره داشت. اما به طور کل استفاده از این ایزوآنزیم­ها به اندازه روش­های که بر اساسPSA  طراحی شده فراگیر و کاربردی نشده­اند.

1-4- ظهور روش­های جدید مولکولی برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی

با توجه به پیشرفته­های روز افزون علوم سلولی مولکولی در عرصه­های مختلف و به­کارگیری روش­های نوین آن در زمینه­های مختلف علوم آزمایشگاهی، بخصوص شناسایی مایعات بیولوژیکی کشف شده از صحنه جرم، شاهد پیشرفت چشم­گیری در حل پرونده­های جنایی هستیم. در این خصوص می­توان به بعضی از این روش­ها در رابطه با تشخیص و بررسی لکه­های مشکوک به مایع منی اشاره نمود. که بر اساس وجود یکسری نشانگرهای مولکولی که در ترکیبات مایع منی دیده می­شوند، این شناسایی­ها صورت می­گیرد. در این قسمت سعی شده به بخشی از روش­های جدید و در حال ظهور در حوزه تشخیص مایع منی در پزشکی قانونی و علوم جنایی اشاره شود.

همانند سایر مایعات بیولوژیکی بدن یکسری نشانگرهای ایمونولوژیکی برای مایع منی وجود دارد که با کمک آن­ها می­توان نمونه مایع منی مشکوک را تشخیص داد. بسیاری از روش­های تشخیصی جدیدی که در حال توسعه و به روز رسانی هستند و برای شناسایی لکه مایع منی استفاده می­شوند بر اساس نشانگرهایmRNA  و بر پایه همان اصولی که در حال حاضر برای تشخیص لکه­های خونی بکار برده می­شود، طراحی شده است. پژوهش­های بائر^[46] در خصوص استفاده ازRNA  در علم پزشکی قانونی و علوم جنایی برای تشخیص مایع منی مثالی در این مورد می­باشد ( بائر 2007: 70-74) . روش­های مشابه دیگری برای آنالیز همزمان RNA وDNA  توسط آلوارز^[47] و همکارانش ابداع شده است که می­توان از آن­ها برای شناسایی مایع منی نیز استفاده کرد. پروتامین یک^[48] (PRM1) یکی از نشانگرهای ویژه مایع منی می­باشد که در حال حاضر برای شناسایی مایع منی کاربرد مناسبی دارد ( الوارز، جوسولا و بالانتین[49] 2004: 293)

در سال 2005 بالانتین و جوسولا روشی را بر مبنای RT-PCR ابداع کردن که برای شناسایی مایع منی موثر بود. اساس این روش تشخیص ژن PRM1 و PRM2 (پروتامین 1 و2) در مایع منی است. به علت اهمیتی که این روش داشت حق ثبت اختراع این آزمایش و روش­های مشابه­ای که برای شناسایی سایر ترکیبات دیگر مایعات بیولوژیکی بود به این محققین داده شده است. حساسیت این روش برای شناسایی نمونه­های مشکوک به مایع منی نسبت به سایر مایعات بدن در بالاترین حد می­باشد. به­طوری­که مقدار RNA مورد نیاز برای شناسایی مایع منی و تشخیص هر دو ژن کمتر از 200 پیکوگرم می­باشد. اختصاصیت این روش به اندازه­ای است که این ژن­ها فقط در نمونه­های که حاوی مایع منی باشند تشخیص داده می­شوند (جوسولا و بالانتین 2005: 3-5) .این دو محقق مطالعات مشابه­ای را در سال 2008 بر روی لکه­های مایع منی قدیمی که حدود پانزده ماه قدمت داشتند با استفاده از دو ژنPRM1  وPRM2  انجام دادند که بطور موفقیت آمیزی توانستند با کمک این آزمایش لکه­های قدیمی آغشته به مایع منی را شناسایی کنند ( هاس[50] و همکاران 2008: 38) .

روش RT-PCR برای نشانگرهای دیگری از مایع منی نیز استفاده می­شود. در سال 2006 نوسبامر و همکارانش از کالیکرئین 3 به­عنوان یک ژن نشانگر برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی در RT-PCR بهره بردند. آنالیز نتایج حاصل از این بررسی نشان می­داد که در این آزمایش هیچ واکنش متقاطعی با سایر مایعات دیگر بدن از جمله خون، ترشحات واژن و بزاق، وجود ندارد. همچنین، این نشانگر mRNA مایع منی دارای پایداری قابل توجه­ای می­باشد. به­طوری­که در نمونه­های که بدون هیچ بافر پایدار کننده­ای در دمای اتاق ده روز نگهداری شده­اند نیز قابل شناسایی می­باشد. آزمایشات متعددی در خصوص حساسیت این روش انجام شده است. آنالیز نتایج این آزمایشات نشان می­دهد که در شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی این روش نسبت به سنجش پروتئینی PSA حساس­تر و دقیق­تر می­باشد.

در سال 2010 فلمینگ و هاربیسون^[51] با طراحی روش چندتایی  mRNA برا ی ژن­های ترانس گلوتامیناز 4 مایع منی و PRM2  موفق به شناسایی لکه­های مشکوک به مایع منی شدند. در این تحقیق، آنها توانستند مایع منی بدون اسپرم را شناسایی کنند. این گروه با این روش قادر به شناسایی خون محیطی، خون قاعدگی ، مایع منی و بزاق نیز شدند ( فلمینگ و هاربیسون، 2010: 249).

علاوه بر روش­های مولکولی فوق الذکر که در شناسایی ترشحات مشکوک به مایع منی بکار برده می­شوند، شناسایی و تعیین هویت فرد صاحب نمونه منی بسیار حائز اهمیت می­باشد. یکی از ابزارهای شناسایی متهمین تجاوز به عنف تعیین هویت نمونه­های مایع منی است که قبلا از طریق تست­های تاییدی یا مقدماتی مورد شناسایی قرار گرفته­اند. از ابزار اصلی تعیین هویت از طریق نمونه­های منی شناسایی شده استخراج  DNA مناسب از این نمونه­ها است و آن هم مستلزم به دام انداختن مناسب سلول­های اسپرم موجود در ترشحات مایع منی می­باشد. به علت این­که در نمونه­های منی مربوط به تجاوزات جنسی، اغلب نمونه مورد نظر با سایر نمونه­ها از جمله نمونه فرد مورد تعرض مخلوط می­شود و این­که مقدار آن نسبت به نمونه فرد قربانی خیلی کمتر است اصولا استخراج  DNA در این موارد از نمونه­های منی با مشکلات خاصی روبرو می­شود. در مطالعه­ای که توسط گروه اوتکان اینسی^[52] و همکارانش در سال 2018 صورت گرفته است، آن­ها موفق به ابداع تراشه­های، طراحی شده خاصی، به منظور تسهیل استخراج افتراقی اسپرم در موارد پزشکی قانونی و علوم جنایی شدند (شکل یک). این تراشه جداسازی سلول­های اسپرم از سایر سلول­های که با نمونه مایع منی مخلوط شده است را تسهیل می­نماید. این روش باعث افزایش بازده 70 تا 92 درصدی به دام انداختن سلول­های اسپرم شده است و از سوی باعث کاهش زمان 8 ساعتی به 80 دقیقه نسبت به سایر روش­های که قبلا به این منظور طراحی شده بودند، گردیده است (اینسی و همکاران ، 2018: 3-6) .

شکل یک : شمای از تراشه طراحی شده جهت جداسازی سلول­های اسپرم و استخراج  DNA از آن­ها.

نمونه­های مشکوکی که از صحنه جرم به عنوان مایع منی شناسایی شده­اند حاوی مقادیر زیادی از سلول­های فرد قربانی از جمله سلول­های پوششی آن فرد است، بعد از جمع آوری نمونه­های مورد نظر، نمونه طی یک مرحله بر روی تراشه به مدت یکساعت در دمای اتاق انکوبه می­شود. سپس تراشه مورد نظر با بافر شستشو، شسته می­شود. این بافر باعث جدا شدن سایر سلول­های موجود در نمونه به جز سلول­های اسپرم از سطح تراشه می­شود. در مرحله­ی بعد سلول­های به دام افتاده بر روی تراشه توسط محلول استخراج  DNA، مورد تیمار قرار گرفته و  DNA استخراج شده از سلول­های اسپرم جهت کارهای بعدی از جمله تعیین هویت ذخیره می­شوند.

2- مایع واژینال

2-1- تست­های مقدماتی و مرسوم بکار برده شده در آزمایشگاه­های جنایی برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع واژینال

اگر چه مایع واژینال نسبت به سایر مایعات بیولوژیکی بدن کشف شده از صحنه جرم از جمله خون، منی و بزاق معمول و فراوان نیست. اما همان مقادیر اندکی هم که در صحنه جرم کشف می­شود می­تواند شواهد قابل قبولی را در خصوص تجاوزات جنسی ارائه دهد. با این حال، برای شناسایی مایع واژینال تست­های چندانی وجود ندارد شاید یک دلیل عمده، این باشد که مایع واژینال به خوبی سایر مایعات بدن از جمله مایع منی شناخته نشده است. از سوی دیگر ترکیبات مایع واژینال و سایر ترشحاتی که از دستگاه تناسلی جنس مونث تراوش می­شود بر اساس چرخه قاعدگی در زنان متغییر است، و شناسایی ترکیبات و ترشحات واژینالی را از طریق یک تست خاص مشکل ساز می­کند. البته چندین آزمایش مقدماتی برای شناسایی مایع واژینال وجود دارد که یک اشاره اجمالی به این روش­ها در این بخش خواهیم داشت.

2-1-1- شناسایی ترشحات واژینالی بر اساس سلول­های اپیتلیالی

یکی از تست­های که در شناسایی ترشحات واژینال کاربرد دارد، بر اساس شناسایی سلول­های اپیتلیالی  یا همان سلول­های پوششی گلیگوژنه شده است که با استفاده از یک اسید شیف (PAS)  ^[53] انجام می­شود. این معرف باعث ایجاد رنگ قرمز گلیکوژن­های موجود در سیتوپلاسم شده که از این طریق می­توان ترشحات واژینالی را شناسایی کرد. علاوه­بر این شدت رنگ ایجاد شده معیاری برای تعیین تراکم سلول­ها در نمونه­های به­دست آمده نیز می­باشد. اما از آنجائی­که میزان گلیکوژنه شدن سلول­های اپیتلیالی بر اساس چرخه قاعدگی متفاوت است، این تست روش چندان مطمئنی برای شناسایی ترشحات واژینالی نیست. همچنین، احتمال این­که در برخی از زنان پیش از بلوغ یا در سن یائسگی هیچ سلول گلیکوژنه­ای وجود نداشته باشند زیاد است. بنابراین این روش به راحتی می­تواند نتایج منفی کاذبی داشته باشد. در این آزمایش نتایج مثبت کاذبی در خصوص نمونه­های مربوط به دهان یا مجرای ادراری مردان دیده می­شود. از معایب دیگر این تست این است که، برای انجام این واکنش مقادیر زیادی نمونه احتیاج است و در نهایت، موجب از بین رفتنDNA  موجود در نمونه نیز می­شود ( جمیز،نوردبی و بل[54] 2002: 102).

3-2-1-2 شناسایی ترشحات واژینال بر اساس پپتیداز واژن

روش قدیمی دیگری که برای شناسایی ترشحات واژینال از آن استفاده می­شود بر اساس آنزیمی به نام پپتیداز واژن است که در نمونه­های مایع واژنی، وجود دارد. در این روش با استفاده از الکتروفورز در ژل نشاسته درpH  ای برابر با 4/7، پپتیداز واژن سوبسترای دی پپتید ال-والین- ال- لوسین را هیدرولیز کرده که در ژل نشاسته پس از رنگ­آمیزی کاملا مشخص است. این روش برای هیچ یک از مایعات بدن نتیجه­ی مثبتی را ایجاد نمی­کند و برای نمونه­های حاوی ترشحات واژن تا 64 درصد موارد نتایج مثبت و قابل قبولی را ارائه می­دهد. هم­چنین این آزمایش در شناسایی ترشحات واژینال که با مایع منی یا خون آلوده شده، نیز موفق بوده است ( دیوال[55] 1994: 243). مطالعات نشان می­دهد که می­توان از سایر ترکیبات مایع واژینال از جمله استرازها، الکالین فسفاتاز، بی- گلوکورونیداز و دیافورز سلول­های اپیتلیالی نیز در شناسایی ترشحات واژینال استفاده کرد.

2-1-3- شناسایی ترشحات واژینال بر اساس گیرنده­هایی استروژن

در یکسری مطالعات جامعی که توسط گروهی از محققین علوم جنایی صورت گرفته است، مشخص شد که می­توان گیرنده­های استروژن موجود در نمونه­های آغشته به ترشحات واژینالی را با استفاده از آنتی­بادی­های منوکلونال از طریق روش ایمونوهیستوشیمی شناسایی کرد. در این مطالعه نمونه­های مورد آزمایش از ترشحات واژینالی زنان زنده و اجساد زنانی که فوت کرده بودند و همچنین از پوست ختنه­گاه مردان و مخاط مجرای ادراری آن­ها جمع­آوری شده بود. این نمونه­ها با آنتی­بادی ضد گیرنده استروژن با روش ایمونوهیستوشیمی مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج آزمایشات متعدد نشان داد که به جزء لایه­های سطحی واژینال، گیرنده­های استروژن موجود در تمامی نمونه­های بیوپسی واژن گرفته شده از زنانی که در قید حیات بودند صرف نظر از سن آن­ها، با این روش قابل شناسایی می­باشد. در نمونه­های که مربوط به زنان فوت شده­ای که مدت زیادی از مرگ آن­ها سپری نشده بود (کمتر از 8 ساعت از مرگ آن­ها گذشته بود) نتایج مثبتی برای شناسایی گیرنده­های استروژنی در نمونه­های واژینالی آنها حاصل نشد. در خصوص نمونه­های پوست ختنه­گاه مردان و مخاط مجرای ادراری آن­ها این آزمایش نتایج مثبت کاذبی را نشان می­داد ( هاوسمان، بالتزر و اسچلمان[56] 1996: 10-13).

2-1-4- شناسایی ترشحات واژینال بر اساس نسبت اسید لاکتیک به اسید سیتریک

یکی دیگر از راه­های شناسایی ترشحات واژینالی، از طریق بررسی نسبت اسید لاکتیک به اسید سیتریک موجود در مایع واژن و مقایسه این نسبت در مایع منی است. با داشتن این نسبت می­توان وجود ترشحات واژینال را به تنهایی یا حتی در شرایطی که با ترکیبات دیگری مخلوط شده باشد را شناسایی کرد. مقدار اسید لاکتیک موجود در مایع واژن در مقایسه با مایع منی بسیار بیشتر است و بر عکس مقدار اسید سیتریک موجود در مایع منی نسبت به مایع واژینال بیشتر می­باشد. بررسی این نسبت­ها در شناسایی مایع واژینال می­تواند موثر باشد. با ایزوتاکوفورز موئینگی می­توان این نسبت را محاسبه کرد. نتایج مربوط به ایزوتاکوفورز نشان می­دهد که کلیه­ی نمونه­های که حاوی مایع منی می­باشند غلظت بالاتری از اسید سیتریک را در مقایسه با اسید لاکتیک نسبت به مایع واژینال دارند. سطح سیترات موجود در نمونه­های مایع واژن پس از مقاربت با گذشت زمان کاهش می­یابد، که به نوعی کاهش مایع منی موجود در نمونه­های حاوی ترشحات واژینالی را نشان می­دهد. البته در ادرار و بزاق دهان هم مقدار کمی از هر دو اسیدهای کربوکسیلیک ذکر شده وجود دارد، اما مقدار آنها به اندازه­ای نیست، که بتواند در بررسی­های مربوط به مایع منی و نمونه­های حاصل از ترشحات واژن سر درگمی و ابهام ایجاد کند.

2-2- روش­های جدید مورد استفاده برای شناسایی مایع واژینال در نمونه­های جمع آوری شده از صحنه جرم

تقریبا همه روش­های جدید مولکولی که به تازگی برای شناسایی مایع واژینال توسعه یافته­اند بر اساس نشانگرهای mRNA طراحی شده­اند. همان­طور که در مباحث پیشین توضیح داد شده است، این روش­ها در حال حاضر برای شناسایی و بررسی سایر مایعات بدن نیز استفاده می­شوند. یکی از این روش­ها، روش جسولا و بالانتین می­باشد که مبنی آن بر اساس آنالیز چند گانه نشانگرهای mRNA ^[57] و با استفاده از RT-PCR می­باشد ( بالانتین و جوسولا 2007: 87) .

در این روش شناسایی مایع واژن بر اساس حضور نشانگرهای انسانی مربوط به ژن­های بتا دیفنزین یک^[58] (HBD-1) و موسین 4 ^[59](MUC4) است. این ژن­ها علاوه بر ترشحات واژینال در خون قاعدگی نیز دیده می­شوند، اما در خون موجود در عروق، مایع منی و یا بزاق وجود ندارند. ترشحات واژینال در مقایسه با خون، منی و بزاق، بیشترین حساسیت را نسبت به این آزمایش دارد، به­طوری­که فقط با 12 نانوگرم از RNA اولیه می­توان این دو ژن را در ترشحات واژینال شناسایی کرد( جوسولا و بالانتین 2005: 8 و 9). در تحقیقی که توسط هاس و همکارانش صورت گرفته بود، این گروه موفق شدند این دو نشانگر ژنی را در نمونه­های که طول عمری حدود 15 سال داشتند را با موفقیت شناسایی کنند ( هاس 2008: 36).

در چند سال اخیر شاهد به­کارگیری روش­های جدیدی برای شناسایی ترشحات واژینالی هستیم، که البته مانند روش­های قبلی عمومیت چندانی ندارد. یکی از این روش­ها بر پایه شناسایی 17B-استرادیول^[60] (E2-17b) طراحی شده است. این ترکیب قوی­ترین فعالیت استروژنی را در میان تمام هورمون­های زنانه دارد. در آزمایشی که با استفاده از GC-MS روی مایعات مختلف بدن انجام شد 17B-استرادیول در تمام شش نمونه­ای که حاوی ترشحات واژینالی بودند با وضوح مشخصی شناسایی شدند. تنها نتایج مثبت کاذب در این خضوض مربوط به یک نمونه از ده مورد لکه مایع منی و نه نمونه لکه بزاق مربوط به جنس مونث بود. نتایج حاصل از این آزمایش با یک کیت تجاری الایزا که بر اساس یک آنتی­بادی منوکلونال ضد E2-17b ساخته شده بود مقایسه گردید و نمونه­های ذکر شده نیز با این کیت مورد آزمایش قرار گرفتند که نتایج این تست شبیه به آزمایش GC-MS بود. همان­طور که گفته شد از معایب این روش، بروز برخی از نتایج مثبت کاذبی است که در نمونه­های حاوی مایع منی، ادرار و بزاق زن بوجود می­آید. یکسری مشکلات دیگری در این روش وجود دارد از جمله چسبیدن نمونه­های مورد آزمایش به صفحه­های شیشه­ای که در حین مراحل آماده سازی نمونه­ها ایجاد می­شود. مشکل عمده­ای دیگری که در این روش می­توان به آن اشاره داشت، احتمال بروز پدیده پروزون در واکنش آنتی­ژن – آنتی­بادی است. اما با این وجود این هورمون بخاطر ویژگی­های که دارد، دارای این پتانسیل است که پس از انجام آزمایشات تکمیلی بیشتر و رفع مشکلات ذکر شده به­عنوان یک روش مناسب برای شناسایی لکه­های مشکوک به مایع واژینال مورد استفاده قرار گیرد ( ساکروادا[61] و همکاران 2008: 15).

نتیجه گیری:

ترشحات جنسی، از جمله نمونه­های بیولوژیکی می­باشند که بعد از لکه­های خون توسط ماموران ذیربط، به­وفور در صحنه­های جرم کشف می­شوند، بخصوص در جرایم تجاوز به عنف یکی از فراوان­ترین نمونه­های موجود در صحنه جرم می­باشند که نقش بسیار مهمی در شناسایی و کشف جرم در این گونه پرونده­ها دارند. لذا بکارگیری روش یا روش­های دقیق و حساس برای شناسایی این نوع ترشحات بسیار حائز اهمیت می­باشد، که در راستای شناسایی صحیح نوع لکه در مراحل اولیه می­توان، با بکارگیری روش­های ژنتیک مولکولی هویت فرد صاحب نمونه، را نیز شناسایی نمود. اهمیت انتخاب روش مناسب زمانی دو چندان می­شود که نمونه­های به دست آمده از صحنه جرم مقدار ناچیزی داشته باشند. در این مواقع استفاده از روش­های دقیق که اصولا جزء تست­های تاییدی هستند، بسیار کارگشا می­باشند. در این خصوص روش­های مولکولی که بر اساس وجود بیان یک ژن خاص که منحصرا در نمونه بیولوژیکی مورد نظر از جمله ترشحات جنسی بیان می­شود از اهمیت بیشتری برخوردار می­باشند، به دلیل اینکه با کمک این روش­ها به صورت کاملا اختصاصی می­توان نمونه بیولوژیکی مورد نظر را از سایر نمونه­های دیگر تشخیص داد (بطور مثال ژن پروتامین یک که در مایع منی بروز می­کند). از اینرو با استفاده و به­کارگیری مناسب روش­های نوین مولکولی در زمینه­های مختلف علوم آزمایشگاهی جنایی، بخصوص شناسایی مایعات بیولوژیکی کشف شده از صحنه جرم از جمله ترشحات جنسی، می­توان شاهد پیشرفت چشم­گیری در حل پرونده­های جنایی باشیم.

منابع

زندیه، سعید و سعادتی، مجتبی. (1388) شناسایی مایع منی و بزاق با استفاده از پردازشگر نور (PL500)، کارآگاه،

       شماره 6.  

مرادی، نسرین سادات و خارا، افشین. (1394) رو ش­های اسپکترومتری برای تجزیه جنایی مایعات بدن، کارآگاه،

       شماره 31.  

References

Zandiyeh, Saeed and Saadati, Mojtaba (1388), “Identification of Semen and Saliva Using Light Processor (PL500), Karagah Magazine, No.6.

Moradi, Nasrin and Khara, Afshin (1394), “Spectroscopic Methods for Criminal Analysis of Body Fluids”, Karagah Magazine, No.31.    

Alvarez, Michelle, Jane Juusola, and Jack Ballantyne. 2004. “An MRNA and DNA Co-Isolation Method for Forensic Casework Samples.” Analytical Biochemistry 335 (2): 289–298.

Ballantyne, Jack, and Jane Juusola. 2007. Messenger RNA Profiling: Body Fluid Identification Using Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Google Patents. https://www.google.com/patents/US7270983.

Bauer, M. 2007. “RNA in Forensic Science.” Forensic Science International: Genetics 1 (1): 69–74.

Borges, Émilie, Agnès Degiuli, Stéphanie Desrentes, Céline Popielarz, Loïc J. Blum, and Christophe A. Marquette. 2017. “EVALUATION OF THE SPERM TRACKER^TM FOR SEMEN STAINS ON LOCALIZATION ON FABRICS.” J Forensic Res 8 (380): 2.

Christian, Cindy W., Jane M. Lavelle, Allan R. De Jong, John Loiselle, Lewis Brenner, and Mark Joffe. 2000. “Forensic Evidence Findings in Prepubertal Victims of Sexual Assault.” Pediatrics 106 (1): 100–104.

Divall, G. B. 1994. “A New Peptidase Isozyme Which May Assist in the Identification of Vaginal Debris.” Forensic Science International 24 (4): 239–246.

Fleming, Rachel I., and SallyAnn Harbison. 2010. “The Development of a MRNA Multiplex RT-PCR Assay for the Definitive Identification of Body Fluids.” Forensic Science International: Genetics 4 (4): 244–256.

Gabby, Tina, Marilyn A. Winkleby, W. Thomas Boyce, Deborah L. Fisher, Allison Lancaster, and George F. Sensabaugh. 1992. “Sexual Abuse of Children: The Detection of Semen on Skin.” American Journal of Diseases of Children 146 (6): 700–703.

Haas, Cordula, B. Klesser, A. Kratzer, and W. Bär. 2008. “MRNA Profiling for Body Fluid Identification.” Forensic Science International: Genetics Supplement Series 1 (1): 37–38.

Harel, V. S., S. R. Khairkar, K. V. Kulkarni, and M. K. Malve. 2015. “Detection of Semen Stains in Rape Cases by a Very High Powered UV-VIS Light Source, Facilitated Conviction of Accused Person.” Journal of Forensic Research 6 (4): 1.

Hausmann, R., M. Baltzer, and B. Schellmann. 1996. “The Forensic Value of the Immunohistochemical Detection of Oestrogen Receptors in Vaginal Epithelium.” International Journal of Legal Medicine 109 (1): 10–13.

Healy, Declan A., Conor J. Hayes, Paul Leonard, Louise McKenna, and Richard O’Kennedy. 2007. “Biosensor Developments: Application to Prostate-Specific Antigen Detection.” TRENDS in Biotechnology 25 (3): 125–131.

Hooft, P., and H. Van de Voorde. 1992. “Evaluation of the Modified Zinc Test and the Acid Phosphatase Test as Preliminary Screening Methods in Sexual Assault Case Material.” Forensic Science International 53 (2): 135–141.

Hooft, Peter J., and Herman P. van de Voorde. 1997. “Bayesian Evaluation of the Modified Zinc Test and the Acid Phosphatase Spot Test for Forensic Semen Investigation.” The American Journal of Forensic Medicine and Pathology 18 (1): 45–49.

Hopkins, Harry, Kevin Noppinger, Nancie H. Jones, and R. Odger Morrison. 1987. “An Evaluation of an Enzymatic Choline Determination for the Identification of Semen in Casework Samples.” Journal of Forensic Science 32 (4): 1069–1074.

Inci, Fatih, Mehmet O. Ozen, Yeseren Saylan, Morteza Miansari, Duygu Cimen, Raghu Dhara, Thiruppathiraja Chinnasamy, Mehmet Yuksekkaya, Chiara Filippini, and Deepan Kishore Kumar. 2018. “A Novel On-Chip Method for Differential Extraction of Sperm in Forensic Cases.” Advanced Science 5 (9): 1800121.

Jackson, D., and S. Hadi. 2007. “The Use of Polilight in the Detection of Seminal Fluid, Saliva, and Bloodstains and Comparison with Conventional Chemical-Based Screening Tests. J Forensic Sci 2006; 51 (2): 361-70.” Journal of Forensic Sciences 52 (3): 740–author.

James, Stuart H., Jon J. Nordby, and Suzanne Bell. 2002. Forensic Science: An Introduction to Scientific and Investigative Techniques. CRC press.

Jones, E. L. 2005. “The Identification of Semen and Other Body Fluids.” Forensic Science Handbook, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ, 329–382.

Juusola, Jane, and Jack Ballantyne. 2005. “Multiplex MRNA Profiling for the Identification of Body Fluids.” Forensic Science International 152 (1): 1–12.

KATSUMATA, Yoshinao, Masakazu OYA, and Shigehiko MIZUTANI. 1991. “Limited Usefulness of Glycylproline Dipeptidyl Aminopeptidase as an Indicator of Seminal Stains.” Jpn J Legal Med I35 5: 356–359.

Kearsey, J., H. Louie, and H. Poon. 2001. “Validation Study of the ‘Onestep Abacard® PSA Test’ Kit for RCMP Casework.” Canadian Society of Forensic Science Journal 34 (2): 63–72.

Kido, A., M. Oya, Y. Katsumata, O. Suzuki, K. Fujisawa, and K. Miyake. 1999. “Comparison of the Specificity and the Sensitivity between the Leucine Aminopeptidase (LAP) Test and the Acid Phosphatase (ACP) Test.” Acta Crim. Jpn 45: 127–130.

Maher, Jeannie, Sue Vintiner, Douglas Elliot, and Lisa Melia. 2002. “Evaluation of the BioSign PSA Membrane Test for the Identification of Semen Stains in Forensic Casework.” The New Zealand Medical Journal 115 (1147): 48–49.

Manabe, F., A. Tsutsumi, Y. Yamamoto, Y. Hashimoto, and H. Ishizu. 1991. “The Identification of Human Semen by a Chemiluminescent Assay of Choline.” Nihon Hoigaku Zasshi= The Japanese Journal of Legal Medicine 45 (3): 205–215.

Miller, Kevin WP, Jennifer Old, Brian R. Fischer, Brett Schweers, Simona Stipinaite, and Karl Reich. 2011. “Developmental Validation of the SPERM HY-LITERTM Kit for the Identification of Human Spermatozoa in Forensic Samples.” Journal of Forensic Sciences 56 (4): 853–865.

Nussbaumer, Christa, Elisabeth Gharehbaghi-Schnell, and Irina Korschineck. 2006. “Messenger RNA Profiling: A Novel Method for Body Fluid Identification by Real-Time PCR.” Forensic Science International 157 (2): 181–186.

Oki, Y., A. Tsutsumi, and H. Ishizu. 1988. “Medicolegal Identification of Semen by an Isotachophoretic Assay of Choline.” Nihon Hōigaku Zasshi= The Japanese Journal of Legal Medicine 42 (1): 1.

Rodriguez, Jae Joseph Russell B., Gayvelline C. Calacal, Rita P. Laude, and Maria Corazon A. De Ungria. 2019. “Integrating Presumptive and Confirmatory Semen Tests into DNA Profiling of Sexual Assault Evidence: A Philippine Example.” Egyptian Journal of Forensic Sciences 9 (1): 45.

Sakurada, K., H. Motani, T. Akutsu, H. Ikegaya, and H. Iwase. 2008. “Identification of Vaginal Stains by Detection of 17 β-Estradiol.” Canadian Society of Forensic Science Journal 41 (1): 13–19.

Sato, S., F. Moriya, Y. Yamamoto, and H. Ishizu. 1996. “Assay of Polyamine in Semen and Seminal Stains by HPLC with Fluorometric Determination of O-Phthalaldehydederivatives.” In Current Topics in Forensic Science: Proceedings of the 14th Meeting of the International Association of Forensic Sciences, Shunderson Communications, Tokyo, Japan, 40–43.

Seiden, HOWARD, and GEORGE T. Duncan. 1983. “Presumptive Screening Test for Seminal Acid Phosphatase Using Sodium Thymolphthalein Monophosphate.” Journal-Association of Official Analytical Chemists 66 (1): 207–209.

Suzuki, O., A. Kido, and M. Oya. 1983. “Zinc Test as a New Tool for Identification of Human Seminal Stains.” Forensic Science International 22 (2–3): 231–235.

Yousef, George M., Christina V. Obiezu, Liu-Ying Luo, Margot H. Black, and Eleftherios P. Diamandis. 1999. “Prostase/KLK-L1 Is a New Member of the Human Kallikrein Gene Family, Is Expressed in Prostate and Breast Tissues, and Is Hormonally Regulated.” Cancer Research 59 (17): 4252–4256.